感染性疾病微生物检测技术包括传统的感染标本涂片镜检和培养、免疫学和分子学方法。近年基于即时快检（Point-of-care testing，POCT ）和以宏基因测序（mNGS)为代表的分子技术发展较快，为重症感染进行精准抗感染治疗提供帮助。值得一提的是，无论何种检测方法，规范地获取微生物标本，对微生物检测和病原学诊断都至关重要。为此本章节将从标本采集、检测技术和结果解读予以阐述。
 
一、标本采集与微生物检查与结果解读
 
临床考虑脓毒症、重症肺炎或疑似感染相关的急危重症时，都应尽量在使用抗微生物药物之前，积极留取标本行微生物检查，而规范的标本采集对任何微生物检测方法所得结果的正确性都是最重要的保证。
 
1.标本的采集
 
（1）呼吸道标本：主要包括痰（气道吸引物）、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、胸水和肺组织。标本应尽可能进行涂片镜检[如革兰染色、抗酸染色（包括针对诺卡菌的弱抗酸染色）、氢氧化钾浮载剂镜检、六胺银染色等]、培养、抗原、核酸定量等检测。
 
呼吸道标本可通过非侵入性或侵入性方法获得。非侵入性方法指经咳痰、鼻咽拭子、鼻咽吸引物或气管导管内吸引（Endotracheal aspiration，ETA）收集标本；侵入性方法指经支气管镜留取下呼吸道标本（如BALF）、经支气管镜或经皮肺穿刺活检留取组织标本等。与非侵入性标本半定量培养相比，侵入性标本定量培养并没有优势^[1,2]。气道分泌物定量培养技术要求高，不一定能改变预后，仅限在有条件的单位开展。对重症肺炎患者，建议通过非侵入性方法留取呼吸道分泌物涂片及半定量培养；经验性治疗无效、疑似特殊病原菌感染或采用常规方法获得的呼吸道标本无法明确致病菌时，可通过侵入性方法采集标本行微生物检查。对于呼吸机相关性肺炎（VAP）患者，除了常规经气管导管吸取呼吸道分泌物涂片和半定量培养外，可通过侵入性方法采集标本以明确病原菌；每周两次的气道分泌物培养有助于预测VAP的病原学^[3]；若定量培养结果已转为阴性，有助于判断是否需要及时停用抗菌药物^{[4, 5]}。
 
有必要提醒的是，基于mNGS技术的广泛应用，在ICU送检呼吸道标本时仅作mNGS而忽略传统涂片和培养方法的做派是欠妥的，因采样环境污染可能性较大，mNGS结果误导病原诊断机会增多，应该保持传统检测方法同步进行，以保证对病原学检测的准确判断。
 
（2）血液：血培养不仅是诊断血流感染的重要方法，也是脓毒症、重症肺炎（包括CAP、HAP/VAP）等重症感染性疾病获取可靠病原学证据的方法，尤其是某些存在下呼吸道标本侵入性操作禁忌的患者。同时，若血培养与下呼吸道标本培养的微生物是一致时，更有助于判断下呼吸道标本培养微生物是感染，而非定植或污染。
 
常规而言，成人每次应采集2~3套，每套从不同穿刺点进行采集。从同一穿刺点采集的血液标本，通常分别注入需氧和厌氧培养瓶，每瓶采血量8ml~10ml，以提高阳性率。采血应在寒战或发热初起时，抗菌药物应用之前采集最佳。
 
（3）胸腔积液：HAP/VAP合并胸腔积液时，可行胸膜腔穿刺抽液送常规、生化、革兰及抗酸染色涂片、培养等检测。
 
（4）腹腔积液：临床指征出现但不局限于发热、腹胀、腹部疼痛、压痛、反跳痛时，应尽可能在抗菌药物使用前采集，严格执行无菌操作，标本采集后注入无菌瓶/无菌试管后立即送检，通常室温15min内应送至实验室，若不能及时送检，不可冷藏。室温保存不得超过24ｈ。腹水如需厌氧菌检测，则应在使用标本采集管留取腹水后，把试管放置在厌氧袋等无氧条件下迅速送检或将腹水直接注入厌氧血培养瓶中送检。
 
（5）脑脊液：怀疑患者为中枢系统感染时，应在使用抗菌药物前立即采集脑脊液。严格执行无菌操作，收集脑脊液5～10ml，分别置于3支无菌试管中，第一管为化学/免疫学检查，第二管为细菌学检查，第三管为细胞学检查。标本采集后应立即送检，不超过1h，脑脊液标本不可冷藏。临床怀疑脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等苛养菌感染时，标本注意保温送检；若怀疑厌氧菌感染，可将脑脊液直接注入血厌氧培养瓶，迅速送检^[7]。
 
（6）穿刺组织：无菌条件下获得的组织标本，宜置于无菌器皿，尽可能在2小时内交与微生物实验室处理。
 
基于ICU可能收治一些可疑烈性传染病（如SARS、高致病性流感、肺炭疽、肺鼠疫等），对这类患者标本，需在采集、运送或保存过程中必须注意生物安全保护。避免传染病传播。
 
2.病原学结果判断
 
（1）微生物涂片：合格的气道分泌物标准为：中性粒细胞数＞25个/低倍镜视野，上皮细胞数＜10个/低倍镜视野，或二者比值＞2.5﹕1。涂片检出≥2%的白细胞内有微生物吞噬为阳性^[6]。对于VAP患者，经气管导管吸引分泌物涂片阳性且与培养结果一致，对病原学诊断有一定参考价值，可作为初始经验性抗感染治疗的依据^[8-13]。
 
（2）微生物培养：传统上认为痰定量培养的细菌浓度≥10⁷ cfu/ml、经ETA细菌培养浓度≥10⁵ cfu/ml、经BALF培养细菌浓度≥10⁴ cfu/ml或经支气管镜防污染样本毛刷（Protected specimen brush，PSB）所取样本培养的细菌浓度≥10³cfu/ml为致病菌的可能性大^[14-16]。机械通气患者的气道和/或人工气道易有不动杆菌属、假单胞菌属、念珠菌属定植，培养到这些微生物时需鉴别是否为致病菌。建议综合评估以下三方面来判定：①宿主情况：免疫状态、基础疾病、目前临床表现等；②细菌因素：气道分泌物涂片镜检是否存在白细胞吞噬现象及与培养结果是否一致、分离到的细菌菌落计数；③抗菌药物因素：近期抗菌药物使用情况、针对该病原菌治疗后临床是否改善。如果患者无与肺炎相关的临床表现及实验室依据，气道分泌物检出细菌很可能为定植或污染。虽然血培养对早期明确诊断、针对性选择抗菌药物有重要意义，但即使血培养阳性，亦不能判定细菌来自于肺内，源自肺部的菌血症约10%～37%^{[15, 17-21]}。胸腔积液培养阳性有助于明确病原学，标本来源于胸腔穿刺术或首次置管时，结果是可靠的；而由已留置的胸管直接抽取时则需谨慎解读其结果，注意污染的可能（ⅢC）。呼吸道病毒培养阳性，可作为确诊病毒感染的依据^[22]。
 
ICU患者中免疫功能低下患者常见，故常有一些同样导致重症感染的特殊病原体感染发生，需要使用特殊培养基或延长培养时间（>3天），因此临床医生下医嘱时予以特别说明，有助与提高涂片或培养阳性率，协助ICU医生早期精准目标性抗感染治疗的成功率。这些病原体包括：诺卡菌、尖端赛多孢子菌、马尔尼菲蓝状菌、荚膜组织胞浆菌、申克孢子菌和结核分枝杆菌复合群等。
 
（3）急性期和恢复期双份血清特异性呼吸道病毒或非典型病原体的IgG抗体滴度呈4倍或4倍以上变化或IgM抗体由阴转阳具有回顾性确诊的价值。肺炎链球菌和嗜肺军团菌尿抗原检测，隐球菌荚膜多糖抗原检测具有很高的敏感性和特异性。血清1,3-β-D葡聚糖（G试验）、血清或BALF半乳甘露聚糖抗原（GM）检测连续两次（BALF仅需一次）阳性，具有辅助诊断价值。
 
（4）应用宏基因组二代测序（Metagenome next generation sequencing，mNGS）分子生物学技术检测出病原微生物，是近年病原学检测一大热点。该方法不依赖于传统病原菌培养，可直接对样本中的核酸进行高通量测序，单次检测就可获得标本中所有DNA/RNA基因组信息，时效快，产出信息多，为早期诊断感染性疾病提供了重要辅助工具。目前席卷全球的新冠病毒最初就是通过二代测序手段明确的^[23]。但是，测序全流程的规范和测序公司资质目前有效监督和质评行业标准还欠完善，据国家目前两次对mNGS病原检测公司或实验室进行质检，两次检测结果提示实验室整体合格率都不到50%，说明测序实验室的检测能力还有较大提升空间[23]。因此，无论mNGS检测技术如何提升，其结果仅为病原学诊断提供参考，尚不能直接作为诊断依据。需结合流行病学和临床特征、患者治疗转归及随访的“闭环临床过程”，才可综合评估其病原诊断价值。临床医生在解读mNGS时，除加强微生物感染知识学习外，还需熟知mNGS技术的局限性：包括标本中人类基因组的干扰、生物信息学分析、结果判断和解释等，特别是呼吸道本身为非无菌状态，大量定植菌核酸的存在，对临床结果的判读带来挑战^[24-26]。
 
3.基于病原学检测的POCT应用
 
POCT 是指任何“在床边”或接近床边执行的诊断工具，不依赖于中央实验室测试，现广泛用于 ICU，最常用的是测量血糖、血红蛋白浓度和动脉血气测试。而对于感染性疾病的病原学和感染标志物（如PCT）的POCT近几年正在兴起。主要为基于病原体抗原和抗体检测的胶体金技术，如甲乙型流感抗原、呼吸道合胞病毒抗原（鼻咽部分泌物）、军团菌抗原（尿）、隐球菌抗原、恶性疟原虫循环抗原和间日疟原虫抗原、班氏丝虫抗原及利什曼原虫抗原的检测等；基于抗体检测的艾滋病病毒抗体，肾综合征出血热病毒抗体、乙型脑炎血清特异性抗体、单纯疱疹病毒抗体、人巨细胞病毒IgM抗体、风疹病毒抗体、登革热病毒抗体等。新近针对曲霉菌的半乳甘露聚糖侧流检测分析（Lateral flow assay, LFA)，对于高度疑似侵袭性曲霉感染患者，可在床旁取BALF，上样后 15 分钟至 1 小时内获得结果。LFA 的灵敏度为 0.88-0.94，特异性为 0.81，ROC 曲线下面积为 0.90-0.94，表明整体测试性能良好，对及时启动抗真菌抢先治疗有益，同时后续再补充如 GM、PCR 或培养，来验证 LFA 测试结果的诊断价值。既满足早期充分治疗，又可规避过度抗真菌治疗的风险，在提高侵袭性曲霉菌感染患者的生存率和降低患者医疗负担之间取得最大的平衡^[27]。
 
此外， POCT还可应用于C反应蛋白 (CRP) 和降钙素原 (PCT)的即时检测，在 VAP 中，CRP 的敏感性为 56% 至 88%，特异性为 86% 至 91%，对快速鉴别细菌感染和非细菌感染（病毒和非感染性疾病）所致重症肺炎也具备诊治价值。
 
基于mNGS技术的POCT现在也正蓬勃发展。Pendleton等报告使用重量小于100 克的手掌大小的设备：MinION进行全基因组测序，允许在大约4小时内鉴定所有研究样本和 55个样本中的51个的抗微生物药敏试验（Antimicrobial susceptibility testing，AST），在 ICU 环境场景中有适用性^[28,29]。
 
4.其它新型微生物检测技术
 
呼出气分析（VOC）是近年用于肺部感染的无创性检测方法。通过细菌、真菌感染产生的有机化合物，利用质谱技术予以分析，为明确是否感染提供依据。Schnabel根据 12 种VOCs的概况，就可以将ICU患者的VAP患者与非VAP患者区分开来^[30]。VOC是一种有前途、简单、安全且无创的VAP快速诊断技术。但其需要更大的研究人群来证实，目前距离临床应用还有一定距离。
 
二、细菌耐药监测体系以及指导意义
 
细菌耐药性已成为全球医疗领域中最受关注的问题。我国是世界上抗生素使用大国，也是不合理使用抗菌药物较为严重的国家之一。为遏制细菌耐药，全球已有多个国家或地区组成细菌耐药性监测网进行相关工作。
 
在中国目前主要由两大细菌耐药性监测平台：CARSS与CHINET。CARSS网全称：全国细菌耐药监测网（China antimicrobial resistance surveillance system，简称CARSS）。2005年8月，原卫生部、国家中医药管理局和总后卫生部联合印发《关于建立抗菌药物临床应用和细菌耐药监测网的通知》（卫办医发〔2005〕176号），建立了全国“抗菌药物临床应用监测网”和“细菌耐药监测网”（以下简称“两网”）。2012年，原卫生部、国家中医药管理局和总后卫生部联合印发了《关于加强抗菌药物临床应用和细菌耐药监测工作的通知》（卫办医政发〔2012〕72号），进一步明确了管理机制，扩大了监测范围，并正式委托国家卫生计生委合理用药专家委员会负责CARSS网的日常运行和管理。目前，全国细菌耐药监测网成员单位已发展至覆盖全国31个省、直辖市和自治区的1412所医疗机构。监测网设有南、中、北三个技术分中心和一个质量管理中心，每个省份设有省级监测中心，同时，还设有全国细菌耐药监测学术委员会。监测方式主要为被动监测，不定期开展主动监测和目标监测。将医疗机构常规微生物药敏实验数据按季度定期经细菌耐药监测信息系统上报至主管部门，通过计算机和人工分析处理，每年度统计出临床常见致病菌对各类抗菌药物的敏感率和耐药率，编写年度细菌耐药监测报告，并持续监测细菌耐药性变迁情况。
 
CHINET是由复旦大学华山医院抗生素研究所牵头，在2004年成立在全国各大区建立细菌耐药性监测点即CHINET细菌耐药性监测网。监测网入网医院运用WHO细菌耐药性监测理念，按照统一的试验方案，采用统一的材料、统一的方法和判断标准进行细菌耐药性监测，以期获得统一、准确、代表性更广的监测数据，指导临床合理用药，并供医疗、制药、卫生保健等部门参考。监测网，成立目标为打造精品化的细菌耐药监测网络，了解重要耐药细菌的变迁规律，为抗菌药物合理使用提供科学依据。根据CHINET发表的数据指出，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）2017年至2022年的检出率仍高于22%，2022年上半年CRKP的检出率为22.8%。肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2017年的20.9% 和24.0% 上升到 2021年上半年的26.0% 和27.5%；铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2017年的23.6% 和20.9% 到2022年上半年的23.8%和19.2%；鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2017年的66.7%和69.3%上升到2022年上半年的69.8%和70.9%^[33-37]。经过十余年发展，目前CHINET监测网成员医院目前监测网71家成员单位来自全国29个省、市和自治区，包括51家综合性医院和20家儿童医院，其中三级医院55家，二级医院16家。覆盖全国13亿人口聚居区，年监测菌株数目逾30万。迄今为止监测了超过200万株细菌耐药监测数据，并据此构建了准确和代表性广的细菌耐药监测数据库，推动了国内抗菌药物使用的规范化和临床用药观念转变，用数据揭示了临床重要耐药细菌的变迁规律。监测网建立了专门的网站chinets.com，每年将最新的病原菌检出，耐药变迁趋势图、重要耐药菌的热图公布方便广大关注者使用并进行学术交流。相关论文已经发表于《Lancet》, 《Lancet Infectious Diseases》, 《Clinical Infectious Diseases》, 《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》等领域内知名期刊。为临床的抗菌药物合理使用提供更好的科学依据，拯救更多患者的生命。
 
所有耐药监测数据都根据CLSI、EUCAST和USCAST折点判断耐药情况，近年来，折点发生改变的主要是多黏菌素和β-内酰胺酶抑制剂。CLSI认为多黏菌素药敏结果不宜报“敏感”，仅报“中介”和“耐药”。但EUCAST认为多黏菌素的折点不改变，即肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属中，多黏菌素的折点仍为S≤2 mg/L、R＞2 mg/L，USCAST与EUCAST一致，S≤2 mg/L、R≥4 mg/L，但USCAST指出不此折点不适用于下尿路感染，主要是多黏菌素B不随尿液排出体外^[31]。我国专家认同EUCAST的意见，仍建议多黏菌素报“敏感”，主要基于我国目前可使用治疗CRO感染的药物仍有限。β-内酰胺酶抑制剂能抑制细菌产生的部分β-内酰胺酶，目前，临床上常用的β-内酰胺酶抑制剂主要有：克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿维巴坦、雷利巴坦、法硼巴坦。基于国外针对CRO的新加酶抑制普遍上市，包括头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、美罗培南/法硼巴坦以及亚胺培南-西司他丁/雷利巴坦CLSI也补充了相应药物折点，但我国目前大多实验室尚未增设相应药物的药敏板条，因此常规耐药监测仍无法提供这些新新加酶抑制的药敏结果。目前相关机构正积极推动对新加酶抑制剂的药敏卡研发，尽快满足临床针对CRO感染的精准用药。
 
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